पीटर सार्नो द्वारा संपादित, स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी, कैलिफोर्निया, 25 दिसंबर, 2020 को अनुमोदित (25 अक्टूबर, 2020 को समीक्षा की गई)
हम कोरोना वायरस-प्रतिलेखन परिसरों की प्रतिकृति में उप-इकाइयों के बीच बातचीत की रिपोर्ट करते हैं, जो प्रतिकृति और विकासवादी संरक्षण के लिए आवश्यक हैं।हमने साक्ष्य प्रदान किया कि nsp12 से जुड़े NiRAN डोमेन में ट्रांस में न्यूक्लियोसाइड मोनोफॉस्फेट (NMP) ट्रांसफरेज़ गतिविधि है, और nsp9 (एक RNA बाइंडिंग प्रोटीन) को इसके लक्ष्य के रूप में पहचाना गया है।NiRAN एक प्रतिक्रिया में संरक्षित nsp9 अमीनो टर्मिनस के लिए NMP भाग के सहसंयोजक लगाव को उत्प्रेरित करता है जो Mn2+ आयनों और आसन्न संरक्षित Asn अवशेषों पर निर्भर करता है।यह पाया गया कि NiRAN गतिविधि और nsp9 NMPylation कोरोनोवायरस प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं।डेटा हमें नेस्टेड वायरस एंजाइम मार्कर की इस गतिविधि को परिकल्पना में पिछली टिप्पणियों से जोड़ने की अनुमति देता है कि आरएनए वायरस के एक वर्ग में आरएनए संश्लेषण की शुरुआत कार्यात्मक और विकासात्मक रूप से सुसंगत है।
निडोविरालेस (कोरोनाविरिडे, आर्टेरियोविरिडे और 12 अन्य परिवार) का आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ (आरडीआरपी) पॉलीप्रोटीन से जारी गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (एनएसपी) में एमिनो-टर्मिनल (एन-टर्मिनल) डोमेन से जुड़ा हुआ है, जिसे नीआरएएन कहा जाता है। 1ab वायरल मेन प्रोटीज़ (Mpro) से बना है।पहले, धमनी वायरस NiRAN-RdRp nsp की अपनी GMPylation/UMPylation गतिविधि की सूचना दी गई थी, और यह सुझाव दिया गया था कि न्यूक्लियोसाइड मोनोफॉस्फेट (NMP) को (वर्तमान में अज्ञात) वायरस और/या सेल बायोपॉलीमराइज़ेशन चीजों में स्थानांतरित करने के लिए एक क्षणिक उत्पन्न किया जाए।यहां, हम दिखाते हैं कि कोरोना वायरस (मानव कोरोना वायरस [HCoV]-229E और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोना वायरस 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) में Mn2+-निर्भर NMPylation गतिविधि है, जो Mpro-मध्यस्थता nsp9 के गठन के माध्यम से nsp9 से प्राप्त होती है। एन-टर्मिनल फ़्लैंकिंग एनएसपीएस को प्रोटियोलिटिक रूप से जारी किया जाता है, फॉस्फोरामिडेट एनएसपी9 के एन-टर्मिनल पर प्राथमिक एमाइन (एन3825) से जुड़ा होता है।इस प्रतिक्रिया में यूरिडीन ट्राइफॉस्फेट पसंदीदा न्यूक्लियोटाइड है, लेकिन एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट, ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट और साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट भी उपयुक्त सह-सब्सट्रेट हैं।पुनः संयोजक कोरोना वायरस एनएसपी9 और एनएसपी12 प्रोटीन और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किए गए एचसीओवी-229ई म्यूटेंट का उपयोग करके उत्परिवर्तन अध्ययन ने सेल संस्कृति में नीआरएएन-मध्यस्थ एनएसपी9 एनएमपाइलेशन और वायरस प्रतिकृति के लिए आवश्यक अवशेषों को निर्धारित किया।डेटा ने NiRAN सक्रिय साइट अवशेषों की भविष्यवाणी की पुष्टि की और nsp9 NMPylation और इन विट्रो में वायरस प्रतिकृति में nsp9 N3826 अवशेषों की महत्वपूर्ण भूमिका निर्धारित की।यह अवशेष संरक्षित एन-टर्मिनल एनएनई ट्रिपेप्टाइड अनुक्रम का हिस्सा है और कोरोनोवायरस परिवार में एनएसपी9 और इसके होमोलॉग का एकमात्र अपरिवर्तनीय अवशेष साबित हुआ है।यह अध्ययन अन्य नेस्टेड वायरस की एनएमपाइलेशन गतिविधि के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक ठोस आधार प्रदान करता है और एंटीवायरल दवाओं के विकास के लिए संभावित लक्ष्य प्रस्तावित करता है।
निडोविरालेस पॉजिटिव-स्ट्रैंडेड आरएनए वायरस विभिन्न प्रकार के कशेरुक और अकशेरुकी (1, 2) को संक्रमित करता है।इस आदेश में वर्तमान में 14 परिवार (3) शामिल हैं, जिनमें से कोरोनोवायरस परिवार का पिछले 20 वर्षों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है।उस समय, जानवरों के मेजबान से तीन जूनोटिक कोरोना वायरस उभरे और मनुष्यों में गंभीर श्वसन संक्रमण के बड़े पैमाने पर फैलने का कारण बने।जिसमें गंभीर तीव्र संक्रामक रोगों के कारण होने वाली लगातार महामारियाँ भी शामिल हैं।श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)।निडोवायरस एक सामान्य जीनोम संगठन साझा करते हैं, और झिल्ली-बाउंड प्रतिकृति-प्रतिलेखन कॉम्प्लेक्स (आरटीसी) की सबयूनिट 5-²-टर्मिनल दो-तिहाई और वायरस कण के मुख्य संरचनात्मक सबयूनिट, साथ ही कुछ सहायक उपकरण में एन्कोडेड है। .प्रोटीन, जीनोम के 3??² अंतिम तीसरे में एन्कोड किया गया (1)।प्लैनेरियन वायरस (मोनोविरिडे) (8) के एक परिवार को छोड़कर, सभी नेस्टेड वायरस आरटीसी सबयूनिट को दो बड़े खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) ओआरएफ1ए और ओआरएफ1बी में एनकोड करते हैं, जो जीनोमिक आरएनए से अनुवादित होते हैं।ORF1a पॉलीप्रोटीन (पीपी) 1a को एनकोड करता है, और ORF1a और ORF1b संयुक्त रूप से pp1ab को एनकोड करते हैं।ORF1a द्वारा एन्कोड किए गए मुख्य प्रोटीज़ (Mpro) की सामान्य भागीदारी के साथ, pp1a और pp1ab दोनों को प्रोटियोलिटिक रूप से विभिन्न प्रकार के गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (nsps) में संसाधित किया जाता है, जिसे 3CLpro के रूप में भी जाना जाता है, क्योंकि इसमें पिकोर्नावायरस के 3Cpro के साथ समरूपता है ( 9).ऐसा माना जाता है कि इन एनएसपीएस को एक बड़े गतिशील आरटीसी में इकट्ठा किया जाता है, जीनोमिक आरएनए (प्रतिकृति) और सबजेनोमिक आरएनए (प्रतिलेखन) के एक सेट के संश्लेषण को उत्प्रेरित किया जाता है, और ओआरएफ1बी (10??) के डाउनस्ट्रीम में स्थित ओआरएफ की अभिव्यक्ति को समन्वयित करने के लिए उपयोग किया जाता है। ?12).
कोर आरटीसी में आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ (आरडीआरपी) (13), सुपरफैमिली 1 हेलिकेज़ (एचईएल1) (14, 15) और कई आरएनए प्रसंस्करण एंजाइम शामिल हैं, जो मुख्य रूप से ओआरएफ1बी और कोरोनोवायरस परिवार में एन्कोडेड हैं। इसमें एनएसपी12-एनएसपी16 और शामिल हैं। आर्टेरियोविरिडे परिवार में nsp9-nsp12 (संदर्भ 10ââ12 देखें)।RdRp और HEL1 बर्ड्स नेस्ट वायरस के दो (एक-पांचवें) संरक्षित डोमेन का प्रतिनिधित्व करते हैं और अन्य आरएनए वायरस के बीच समरूपता रखते हैं।ऐसा माना जाता है कि कोर प्रतिकृति को अन्य सबयूनिट्स द्वारा सहायता प्रदान की जाती है, जिसमें पीपी1ए के कार्बोक्सी-टर्मिनल (सी-टर्मिनल) क्षेत्र से जारी कई छोटे एनएसपीएस, एमप्रो के डाउनस्ट्रीम (क्रमशः कोरोना वायरस एनएसपी5 और धमनी वायरस एनएसपी4) शामिल हैं।उनके पास सीमित परिवार-विशिष्ट सुरक्षा और विविध गतिविधियाँ हैं (संदर्भ 10-12 में समीक्षा की गई है)।
अपेक्षाकृत हाल ही में, सभी नेस्टेड वायरस में RdRp से सटे अमीनो टर्मिनस (एन-टर्मिनस) पर अद्वितीय अनुक्रम रूपांकनों विशेषताओं वाला एक डोमेन पाया गया था, लेकिन कोई अन्य आरएनए वायरस नहीं (16)।इसके स्थान और न्यूक्लियोटाइड ट्रांसफरेज (न्यूक्लियोसाइड मोनोफॉस्फेट [एनएमपी] ट्रांसफरेज) गतिविधि के आधार पर, इस डोमेन को NiRAN (नेस्टवायरस आरडीआरपी-संबंधित न्यूक्लियोटाइड ट्रांसफरेज) नाम दिया गया है।NiRAN-RdRp का दोहरा-डोमेन संयोजन कोरोनाविरिडे परिवार में nsp12 और आर्टेरियोविरिडे परिवार में nsp9 का गठन करता है, और अन्य नेस्टोविरिडे में, NiRAN-RdRp को वायरल पॉलीप्रोटीन से एक स्वतंत्र एनएसपी के रूप में जारी किए जाने की उम्मीद है।कोरोना वायरस में, NiRAN डोमेन में ??1/450 अवशेष होते हैं और यह लिंकर क्षेत्र (16?19) के माध्यम से सी-टर्मिनल RdRp डोमेन से जुड़ा होता है।इक्वाइन आर्टेराइटिस वायरस (ईएवी) (आर्टेरिविरिडे) में, पुनः संयोजक एनएसपी9 एमएन2+ आयन-निर्भर (स्वयं) यूएमपीयलेशन और जीएमपाइलेशन गतिविधियों को दर्शाता है, जो नेस्टोवायरस, एएन, बीएन और सीएन में तीन संरक्षित अनुक्रम आधारों पर निर्भर करते हैं।जहां N का मतलब NiRAN है) (16)।इन रूपांकनों का एन-टर्मिनल फ़्लैंकिंग एक कम रूढ़िवादी रूपांकन प्रीएएन है।इनमें से कुछ अवशेष दूर से संबंधित प्रोटीन किनेसेस में भी संरक्षित हैं, जहां उन्हें न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपी) बाइंडिंग और उत्प्रेरक गतिविधि (20, 21) में शामिल दिखाया गया है।इस अवलोकन के अनुरूप, स्यूडोमोनस सिरिंज से स्यूडोकिनेज सेलो में कई प्रमुख सक्रिय साइट अवशेषों को हाल ही में प्रकाशित SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 सुपरकॉम्प्लेक्स के साथ इकट्ठा किया जा सकता है।संरक्षित कोरोनावायरस NiRAN अवशेष इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्ट्रक्चर में आरोपित हैं।पुनः संयोजक प्रोटीन (17)।यह अनुमान लगाया गया है कि प्रलेखित (स्वयं) यू/जीएमपाइलेशन एनएमपी को (वर्तमान में अज्ञात) सब्सट्रेट (16) में स्थानांतरित करने के लिए एक क्षणिक स्थिति उत्पन्न करेगा, और नीआरएएन और प्रोटीन काइनेज (17, 19) के बीच संरचनात्मक समानता है। NiRAN अन्य प्रोटीन को संशोधित करता है।
नेस्टेड वायरस के साथ इसके अद्वितीय और अद्वितीय व्यवस्थित जुड़ाव और आरडीआरपी से आनुवंशिक पृथक्करण सहित कई विशेषताएं, NiRAN को नेस्टेड वायरस के लिए एक उचित महत्वपूर्ण नियामक एंजाइम बनाती हैं, जो उनके उद्भव और पहचान के लिए महत्वपूर्ण है।पहले, जीनोम/सबजीनोमिक अनुवाद या प्रतिकृति/प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए NiRAN से जुड़े तीन संभावित कार्यों को बुलाया गया था।उस समय उपलब्ध दुर्लभ और अपूर्ण डेटा पर विचार करते समय, प्रत्येक फ़ंक्शन के अपने फायदे और नुकसान होते हैं (16)।इस शोध में, हमारा लक्ष्य दो जेनेरा का प्रतिनिधित्व करने वाले कोरोनवायरस के जैव रासायनिक और रिवर्स जेनेटिक अध्ययनों को संयोजित करना है, और अपने निष्कर्षों को कोरोनवायरस परिवार के प्राकृतिक उत्परिवर्तन की विकासवादी पृष्ठभूमि में रखना है, ताकि इस रहस्यमय क्षेत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त हो सके।हम आरटीसी में प्राकृतिक लक्ष्यों की पहचान के माध्यम से NiRAN की समझ में प्रमुख प्रगति की रिपोर्ट करते हैं, जो (तीन उपलब्ध परिकल्पनाओं में से) नेस्टेड वायरस आरएनए के संश्लेषण को शुरू करने में इस डोमेन की भूमिका में योगदान देता है।यह शोध वायरस होस्ट इंटरफ़ेस पर NiRAN की अन्य भूमिकाओं के लिए भी संभावनाएं खोलता है।
कोरोना वायरस nsp12-संबंधित NiRAN डोमेन के एंजाइमैटिक गुणों को चिह्नित करने के लिए, हमने ई. कोली में मानव कोरोना वायरस 229E (HCoV-229E) nsp12 का एक पुनः संयोजक रूप तैयार किया, C-टर्मिनस पर His6 टैग के साथ, और इसे संयोजित किया। [α32-पी] के साथ प्रोटीन, सामग्री और विधियों में वर्णित अनुसार एमएनसीएल2 की उपस्थिति में एनटीपी के साथ इनक्यूबेट करें।प्रतिक्रिया उत्पाद के विश्लेषण से एनएसपी12 (106 केडीए) के साथ सह-माइग्रेट होने वाले एक रेडियोलेबल्ड प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत मिलता है, जो दर्शाता है कि कोरोनोवायरस एनएसपी12 सहसंयोजक प्रोटीन-एनएमपी एडक्ट्स के गठन को उत्प्रेरित करता है, जो अधिमानतः यूरिडीन मोनोफॉस्फेट (यूएमपी) (चित्रा 1 ए) के साथ बनता है। बी)।मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि अन्य न्यूक्लियोटाइड्स की तुलना में, यूएमपी निगमन की सिग्नल तीव्रता 2 से 3 गुना बढ़ गई (चित्रा 1सी)।यह डेटा कोरोना वायरस (16) के NiRAN डोमेन की अनुमानित एनएमपी ट्रांसफरेज गतिविधि के अनुरूप है, लेकिन यह दर्शाता है कि कोरोना वायरस और धमनी वायरस के NiRAN डोमेन की न्यूक्लियोटाइड प्राथमिकताएं अलग-अलग हैं।
HCoV-229E nsp12 की स्व-एनएमपीलेशन गतिविधि।(ए) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) को 30 मिनट के लिए 6 mM MnCl2 की उपस्थिति में निर्दिष्ट [α-32P] NTP के साथ ऊष्मायन किया गया था (विवरण के लिए सामग्री और तरीके देखें)।प्रतिक्रिया उत्पादों को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और कूमैसी शानदार नीले रंग से रंग दिया गया।(बी) रेडियोलेबल प्रोटीन को फॉस्फोरस इमेजिंग द्वारा देखा जाता है।Nsp12-His6 और प्रोटीन आणविक द्रव्यमान मार्करों (किलोडाल्टन में) की स्थिति ए और बी में दिखाई गई है। (सी) रेडियोधर्मी सिग्नल की तीव्रता (मतलब ± SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से निर्धारित की गई थी।*P≤0.05.सिग्नल की शक्ति (प्रतिशत) यूटीपी से संबंधित है।
हालाँकि सेल कल्चर (16) में EAV और SARS-CoV की प्रतिकृति के लिए NiRAN-संबंधित एंजाइम गतिविधियों को आवश्यक दिखाया गया है, विशिष्ट NiRAN फ़ंक्शन और संभावित लक्ष्य अभी तक निर्धारित नहीं किए गए हैं।NiRAN और प्रोटीन काइनेज जैसी परतों वाले प्रोटीन परिवार के बीच हाल ही में रिपोर्ट की गई संरचनात्मक समानता ने हमें इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए प्रेरित किया कि NiRAN अन्य प्रोटीनों के NMPylation को उत्प्रेरित करता है।हमने संभावित समजात लक्ष्यों का एक सेट तैयार किया, जिसमें HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) द्वारा एन्कोड किए गए गैर-संरचनात्मक प्रोटीन शामिल हैं, प्रत्येक में C-टर्मिनल His6 टैग (SI परिशिष्ट, तालिका S1) शामिल है, और एनएसपी12 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इन प्रोटीनों को [α32-पी] यूरिडीन ट्राइफॉस्फेट ([α32-पी]यूटीपी) के साथ सेते हैं।ई. कोली में उत्पादित बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन और एमबीपी-लैज़्ज़α संलयन प्रोटीन को नियंत्रण के रूप में कार्य किया जाता है (चित्रा 2ए, लेन 1 से 7)।रेडियोलेबल प्रोटीन का विश्लेषण सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) और ऑटोरैडियोग्राफी द्वारा किया गया था, और यह पाया गया कि एनएसपी 12 और एनएसपी 9 युक्त प्रतिक्रिया में एक मजबूत रेडियोधर्मी संकेत था।सिग्नल की स्थिति एनएसपी9 के आणविक द्रव्यमान से मेल खाती है, जो एनएसपी9 के एनएसपी12-मध्यस्थ यूएमपाइलेशन को दर्शाता है (चित्र 2बी, ट्रैक 7)।कोई अन्य परीक्षण प्रोटीन UMPylated नहीं पाया गया, जिससे हम यह निष्कर्ष निकाला कि nsp9 nsp12 का एक विशिष्ट सब्सट्रेट है।चित्र 1 में दिखाए गए स्व-एनएमपीलेशन डेटा के अनुरूप, एनएसपी12 सभी चार एनएमपी को एनएसपी9 में स्थानांतरित करने में सक्षम है, हालांकि दक्षता अलग है, यूएमपी> एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (एएमपी)> गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट (जीएमपी)> साइटिडाइन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी)) ( चित्र)।3 ए और बी).इस परख में उपयोग की जाने वाली शर्तों के तहत (प्रतिक्रिया और एक्सपोज़र समय को कम करें, एनएसपी 12 की एकाग्रता को कम करें; सामग्री और तरीके), एनएसपी 12 के स्व-एनएमपीलेशन का पता नहीं लगाया जा सका (चित्रा 2 बी, लेन 7 और चित्रा 1 बी की तुलना करें), जो एक प्रभावी साबित हुआ (और कई राउंड) यूएमपी एनएसपी12 से एनएसपी9 पर चला गया।यूएमपी ट्रांसफरेज गतिविधि के लिए एमएन2+ आयनों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है, जैसा कि चित्र 3सी में दिखाया गया है, जबकि एमजी2+ की उपस्थिति में केवल न्यूनतम यूएमपी ट्रांसफरेज गतिविधि देखी गई थी, और परीक्षण किए गए अन्य दो द्विसंयोजक धनायनों की उपस्थिति में कोई गतिविधि नहीं देखी गई थी।इसी तरह का डेटा साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट (सीटीपी), गुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी), और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस 1) युक्त एनएमपाइलेशन परख में प्राप्त किया गया था।
HCoV-229E nsp12-मध्यस्थता nsp9 का UMPylation।HCoV-229E nsp12-His6⁺-मध्यस्थता की UMPylation गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटीन सब्सट्रेट्स की एक श्रृंखला (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, MBP-lacZα, और ORF1a द्वारा एन्कोडेड C-टर्मिनल His6 के साथ लेबल HCoV-229E nsps की एक श्रृंखला) का उपयोग किया गया था। प्रोटीन.सामग्री और विधियों में वर्णित एनएसपी12 की अनुपस्थिति (ए) या उपस्थिति (बी) में 10 मिनट के लिए [α-32पी] यूटीपी के साथ प्रोटीन को इनक्यूबेट करें।ए और बी के शीर्ष पर, कूमैसी ब्रिलियंट ब्लू से सना हुआ एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल दिखाया गया है, और ए और बी के नीचे, संबंधित ऑटोरेडियोग्राम दिखाए गए हैं।प्रोटीन आणविक द्रव्यमान मार्कर की स्थिति (किलोडाल्टन में) बाईं ओर दी गई है।Nsp12-His6 (B, शीर्ष) की स्थिति और nsp9-His6 (B, लेन 7) के साथ nsp12-His6 के ऊष्मायन के दौरान देखे गए रेडियोधर्मी संकेत भी इंगित किए गए हैं, जो इंगित करता है कि [α-32P]UMP से nsp9-His6 (12.9 केडीए), जो परीक्षण किए गए अन्य प्रोटीनों के लिए नहीं देखा गया।
HCoV-229E NiRAN-मध्यस्थता जैव रासायनिक और nsp9 NMPylation का वायरोलॉजिकल लक्षण वर्णन।(ए और बी) प्रतिक्रिया में प्रयुक्त न्यूक्लियोटाइड सह-सब्सट्रेट की भूमिका।Nsp12-His6 और nsp9-His6 को मानक NMPylation परख में विभिन्न [α-32P] NTP की उपस्थिति में मिश्रित और ऊष्मायन किया जाता है।(ए, शीर्ष) कूमैसी-सना हुआ एनएसपी9-हिस6 एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया।(ए, नीचे) जेल के उसी क्षेत्र का ऑटोरेडियोग्राफ़।(बी) निर्दिष्ट न्यूक्लियोटाइड कॉफ़ेक्टर की उपस्थिति में सापेक्ष गतिविधि (माध्य ± SEM) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से निर्धारित की जाती है।*P≤0.05.(सी) धातु आयनों की भूमिका।[α-32P] UTP और विभिन्न धातु आयनों की उपस्थिति में मानक NMPylation परीक्षण दिखाया गया है, प्रत्येक की सांद्रता 1 mM है।C में, शीर्ष पर, Coomassie से सना हुआ nsp9-His6 दिखाया गया है, और C में, नीचे, संबंधित ऑटोरैडियोग्राफी दिखाई गई है।लेबल किए गए प्रोटीन का आकार (किलोडाल्टन में) ए और सी के बाईं ओर दिखाया गया है। (डी) निर्दिष्ट अमीनो एसिड प्रतिस्थापन ले जाने वाले HCoV-229E nsp12-His6 का उत्परिवर्ती रूप [α-32P]UTP में है, जैसा कि वर्णित है सामग्री और विधियों में.NMPylation प्रतिक्रिया में उत्पादित रेडियोलेबल्ड nsp9-His6 का पता फॉस्फोराइलेशन इमेजिंग (D, शीर्ष) द्वारा लगाया जाता है।जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) प्रोटीन की तुलना में सापेक्ष गतिविधि को डी में दिखाया गया है, और नीचे को तीन स्वतंत्र प्रयोग से औसत (±SEM) के रूप में लिया गया है।तारांकन गैर-संरक्षित अवशेषों के प्रतिस्थापन का संकेत देते हैं।(ई) संक्रमण के 24 घंटे बाद प्राप्त पी1 कोशिकाओं के कल्चर सतह पर तैरनेवाला में वायरस टिटर को प्लाक परख द्वारा निर्धारित किया गया था।इंजीनियर्ड HCoV-229E म्यूटेंट के NiRAN डोमेन में कोडन प्रतिस्थापन संकेतित हैं (अवशेष क्रमांकन pp1ab में उनकी स्थिति पर आधारित है)।प्रतिकृति-रहित RdRp सक्रिय साइट उत्परिवर्ती nsp12_DD4823/4AA का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था।
NiRAN की सक्रिय साइट की गहरी समझ हासिल करने और nsp9-विशिष्ट NMP ट्रांसफरेज़ की गतिविधि से संबंधित अवशेषों को निर्धारित करने के लिए, हमने उत्परिवर्तन विश्लेषण किया, जिसमें हमने NiRAN AN, BN और CN रूपांकनों में रूढ़िवादी अवशेषों को प्रतिस्थापित किया ( 16) यह अला (SI परिशिष्ट, चित्र S2) है।इसके अलावा, रूढ़िवादी Arg-to-Lys या Lys-to-Arg प्रतिस्थापनों के प्रभाव का मूल्यांकन दो मामलों में किया गया था।एक (नकारात्मक) नियंत्रण के रूप में, वे अवशेष जो कोरोना वायरस और अन्य नेस्टेड वायरस के NiRAN डोमेन में संरक्षित नहीं हैं या कम हैं, उन्हें Ala से बदल दिया जाता है। K4116A (मोटिफ प्रीएएन में), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (मोटिफ) को प्रतिस्थापित किया जाता है। बीएन) और डी4280ए (सीएन) एनएसपी12 के माध्यम से एनएसपी9 एनएमपाइलेशन को काफी कम कर देता है या समाप्त भी कर देता है, जबकि रूढ़िवादी प्रतिस्थापन (आर4178के), के4116आर) वाले प्रोटीन अपनी गतिविधि का 60% और 80% बरकरार रखते हैं, जो उनके संबंधित पक्ष पर प्रतिबंधों की छूट को इंगित करता है। जंजीरें भौतिक-रासायनिक रूप से संवेदनशील हैं (चित्रा 3डी)।कई अन्य संरक्षित अवशेषों E4145A, D4273A, F4281A और D4283A को प्रतिस्थापित करना बहुत कम हानिकारक है, और nsp9 UMPylation केवल मामूली रूप से कम हुआ है।इसी तरह के परिणाम अन्य एनटीपी (चित्रा 3 डी और एसआई परिशिष्ट, चित्रा एस 3) से जुड़े एनएसपी 9 एनएमपाइलेशन प्रतिक्रियाओं में प्राप्त किए गए थे, यह पुष्टि करते हुए कि विशिष्ट अमीनो एसिड प्रतिस्थापन पर देखे गए प्रभाव इस्तेमाल किए गए न्यूक्लियोटाइड सह-सब्सट्रेट के प्रकार से स्वतंत्र हैं।इसके बाद, हमने सेल कल्चर में कोरोना वायरस की प्रतिकृति पर इन एनएसपी12 प्रतिस्थापनों के संभावित प्रभाव का परीक्षण किया।इस प्रयोजन के लिए, हमने 5-7 कोशिकाओं को प्रतिलेखित करने के लिए पुनः संयोजक वैक्सीनिया वायरस (23, 24) में क्लोन किए गए उपयुक्त आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पूरक डीएनए (सीडीएनए) टेम्पलेट का उपयोग किया।इन कोशिकाओं में उत्पन्न संक्रामक वायरस संतान के अनुमापन से पता चला कि अधिकांश HCoV-229E NiRAN म्यूटेंट संभव नहीं थे (चित्रा 3ई)।गैर-व्यवहार्य वायरल म्यूटेंट के एक समूह में ऐसे विकल्प शामिल हैं जो इन विट्रो (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) में एनएमपी ट्रांसफरेज़ गतिविधि को खत्म करने या महत्वपूर्ण रूप से कम करने के लिए दिखाए गए हैं, लेकिन दो अन्य विकल्प भी हैं (K4116R, E4145A) 80 % आरक्षित?उनकी इन विट्रो एनएमपाइलेशन गतिविधि से पता चलता है कि अतिरिक्त प्रतिबंध शामिल हैं।इसी तरह, दो अन्य उत्परिवर्तन (R4178K, F4281A) जिनके कारण NiRAN की इन विट्रो NMPylation गतिविधि में मामूली कमी आई, ने जीवित वायरस उत्पन्न किए, हालांकि, इन वायरस ने प्रतिकृति के माध्यम से टाइटर्स को काफी कम कर दिया।चित्र 3डी में दिखाए गए इन विट्रो गतिविधि डेटा के अनुरूप, चार अन्य अवशेषों की जगह जो कोरोनोवायरस और/या अन्य नेस्टेड वायरस (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) में संरक्षित नहीं हैं, ने व्यवहार्य वायरस पैदा किए। जंगली प्रकार के वायरस की तुलना में मामूली कम अनुमापांक (चित्रा 3ई)।
यह अध्ययन करने के लिए कि क्या NiRAN-मध्यस्थता NMP ट्रांसफरेज गतिविधि सक्रिय RdRp डोमेन पर निर्भर करती है, RdRp मोटिफ C में द्विसंयोजक धातु आयनों (11) के समन्वय में शामिल दो संरक्षित Asp अवशेषों को Ala द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। परिणामी प्रोटीन nsp12_DD4823/4AA बरकरार रहता है इसकी nsp9 NMPylation गतिविधि, यह दर्शाती है कि nsp12-मध्यस्थ इन विट्रो nsp9 NMPylation गतिविधि को पोलीमरेज़ गतिविधि (SI परिशिष्ट, चित्र S4) की आवश्यकता नहीं है।
एनएसपी12 के लिए एनएसपी9-विशिष्ट एनएमपी ट्रांसफरेज गतिविधि स्थापित करने के बाद, हमने मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा एनएमपी-एनएसपी9 एडक्ट को चिह्नित करने का प्रयास किया।पुनः संयोजक HCoV-229E nsp9 के पूर्ण प्रोटीन द्रव्यमान स्पेक्ट्रम ने 12,045 Da (चित्र 4A) पर शिखर दिखाया।एनएसपी12 को जोड़ने से एनएसपी9 की गुणवत्ता में कोई बदलाव नहीं आया, यह दर्शाता है कि एनएसपी12 और एनएसपी9 इस्तेमाल की गई शर्तों (विकृतीकरण) के तहत एक स्थिर कॉम्प्लेक्स नहीं बनाएंगे (चित्र 4ए)।UTP और GTP की उपस्थिति में, क्रमशः nsp9 और nsp12 युक्त प्रतिक्रिया के द्रव्यमान माप से पता चला कि UTP का प्रोटीन द्रव्यमान 306 Da चला गया, और GTP का प्रोटीन द्रव्यमान 345 Da चला गया, जो दर्शाता है कि प्रत्येक nsp9 अणु एक UMP या GMP को बांधता है। (चित्र 4) सी और डी)।यह अनुमान लगाया गया है कि NiRAN-मध्यस्थता वाले nsp9 NMPylation के लिए आवश्यक ऊर्जा NTP हाइड्रोलिसिस और पायरोफॉस्फेट रिलीज से आती है।हालाँकि इस प्रतिक्रिया में nsp12 (एंजाइम) की तुलना में nsp9 (लक्ष्य) की 10 गुना अधिक दाढ़ का उपयोग किया गया था, nsp9 का लगभग पूर्ण NMPylation देखा गया था, जो दर्शाता है कि nsp12 और nsp9 के बीच की बातचीत अल्पकालिक है, और nsp12 NMPylate को nsp9 से अधिक कर सकता है। इन विट्रो अणु.
Nsp12 और UTP या GTP की उपस्थिति में nsp9 का एकल NMPylation।HCoV-229E nsp9 (SI परिशिष्ट, तालिका S1) (AD) का विघटित पूर्ण प्रोटीन द्रव्यमान स्पेक्ट्रम दिखाया गया है।(ए) अकेले एनएसपी9, (बी) एनएसपी9 + एनएसपी12-हिस6, (सी) यूटीपी की उपस्थिति में एनएसपी9 + एनएसपी12-हिस6, (डी) जीटीपी की उपस्थिति में एनएसपी9 + एनएसपी12-हिस6।
nsp12 द्वारा UMPylated nsp9 अवशेषों को निर्धारित करने के लिए, nsp9-UMP को ट्रिप्सिन के साथ साफ़ किया गया था।परिणामी पेप्टाइड्स को नैनो-उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा अलग किया गया और टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) द्वारा ऑनलाइन विश्लेषण किया गया।बायोनिक सॉफ्टवेयर पैकेज (प्रोटीन मेट्रिक्स) का उपयोग करके डेटा विश्लेषण ने एन-टर्मिनल अमीनो एसिड का यूएमपीलेशन दिखाया।इसकी पुष्टि मैन्युअल रूप से की जाती है.अग्रदूत पेप्टाइड [यूएमपी] एनएनईआईएमपीजीके (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस5ए) के अग्रानुक्रम द्रव्यमान स्पेक्ट्रम ने 421 एम/जेड पर एक टुकड़ा प्रकट किया, जो दर्शाता है कि यूएमपी एनएसपी9 के अवशेष 1 को बांधता है।
एनएसपी9 के एन-टर्मिनस पर, एएसएन ऑर्थोकोरोनविरिने (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस6) के सदस्यों के बीच संरक्षित है।यद्यपि हम मानते हैं कि एन-टर्मिनल प्राथमिक अमीन नाइट्रोजन यूएमपी के लिए सबसे अधिक संभावित स्वीकर्ता है, हमने एन-टर्मिनल पर एनएमपी बाइंडिंग के अतिरिक्त सबूत प्राप्त करने का निर्णय लिया।इस कारण से, एचपीएलसी द्वारा शुद्ध किए गए गैर-एनएमपीलेटेड और एनएमपीलेटेड एन-टर्मिनल पेप्टाइड एनएसपी9 को एसीटोन और सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड की उपस्थिति में प्राप्त किया गया था।इन शर्तों के तहत, केवल मुक्त प्राथमिक अमीनों को प्रोपाइल (25) के साथ संशोधित किया जा सकता है।एनएनईआईएमपीजीके अनुक्रम के साथ एन-टर्मिनल एनएसपी9-व्युत्पन्न पेप्टाइड में दो प्राथमिक एमाइन होते हैं, एक एएसएन के एन-टर्मिनस पर और दूसरा सी-टर्मिनस पर लिस की साइड चेन पर।इसलिए, प्रोपाइल समूहों को दोनों सिरों पर पेश किया जा सकता है।गैर-एनएमपीलेटेड पेप्टाइड्स के निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम एसआई परिशिष्ट, चित्र S5B में दिखाए गए हैं।जैसा कि अपेक्षित था, एन-टर्मिनल और सी-टर्मिनल (मोनो)प्रोपिलेटेड (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस5बी, ऊपरी लेन) और डिप्रोपाइलेटेड पेप्टाइड्स (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस5बी, निचली लेन) की पहचान की जा सकती है।यह पैटर्न nsp9 के NMPylated N-टर्मिनल पेप्टाइड के उपयोग से बदलता है।इस मामले में, केवल सी-टर्मिनल प्रोपाइलेटेड पेप्टाइड्स की पहचान की जा सकती है, लेकिन एन-टर्मिनल प्रोपाइलेटेड पेप्टाइड्स और डिप्रोपाइलेटेड पेप्टाइड्स की पहचान नहीं की जाती है (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस5सी), यह दर्शाता है कि यूएमपी को एन-टर्मिनल प्राथमिक अमीन में स्थानांतरित कर दिया गया है। परिवर्तन करने से समूह.
इसके बाद, हम लक्ष्य-विशिष्ट बाधाओं को परिभाषित करने के लिए एनएसपी9 के एन-टर्मिनस पर संरक्षित अवशेषों को (अला या सेर के साथ) बदलते हैं या हटाते हैं।हमारे एमएस डेटा के आधार पर जो दर्शाता है कि NiRAN, nsp9 के एन-टर्मिनल अवशेषों के प्राथमिक अमाइन के साथ एक nsp9-NMP एडक्ट बनाता है, हमने अनुमान लगाया कि nsp9 NMPylation को nsp9 N-टर्मिनल को रिलीज़ करने के लिए वायरल मास्टर प्रोटीज़ (Mpro, nsp5) की आवश्यकता होती है। इसका पॉलीप्रोटीन अग्रदूत।इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने ई. कोली में nsp9 युक्त एक पूर्ववर्ती प्रोटीन nsp7-11 का उत्पादन किया और [α-32P] UTP (सामग्री और विधियों) की उपस्थिति में एक मानक NMPylation परीक्षण किया।जैसा कि चित्र 5ए (लेन 3) में दिखाया गया है, बिना कटे एनएसपी7-11 अग्रदूत को एनएसपी12 के साथ रेडियोलेबल नहीं किया गया है।इसके विपरीत, यदि nsp7-11 को पूर्ववर्ती से nsp9 (और अन्य nsps) को मुक्त करने के लिए पुनः संयोजक nsp5 द्वारा विखंडित किया जाता है, तो एक रेडियोलेबल प्रोटीन का पता लगाया जाता है जो nsp9 के साथ स्थानांतरित होता है, जो हमारे निष्कर्ष की पुष्टि करता है कि NiRAN और N- सहसंयोजक nsp9-NMP व्यसनों का चयनात्मक गठन .एन-टर्मिनल एएसएन का टर्मिनल प्राथमिक एमाइन (पीपी1ए/पीपी1एबी में स्थिति 3825)।यह निष्कर्ष nsp9 निर्माण का उपयोग करने वाले प्रयोगों द्वारा भी समर्थित है, जिसमें एन-टर्मिनस पर एक या दो अतिरिक्त अवशेष शामिल हैं।दोनों ही मामलों में, nsp9 के NiRAN-मध्यस्थता UMPylation को समाप्त कर दिया गया (SI परिशिष्ट, चित्र S7)।इसके बाद, हमने एनएसपी9 के एन-टर्मिनल पर 3825-एनएनईआईएमपीके-3832 पेप्टाइड अनुक्रम से हटाए गए एक या दो एएसएन अवशेषों के साथ एक प्रोटीन का उत्पादन किया।दोनों ही मामलों में, nsp9 UMPylation पूरी तरह से अवरुद्ध हो गया था (चित्र 5B), अतिरिक्त सबूत प्रदान करता है कि वास्तविक nsp9 N-टर्मिनस NMP रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है।
एनएसपी9 का प्रोटीयोलाइटिक प्रसंस्करण और एनएसपी12-मध्यस्थता यूएमपाइलेशन में एन-टर्मिनल अवशेषों की भूमिका।(ए) एनएसपी9 यूएमपाइलेशन के लिए एक मुफ्त एनएसपी9 एन-टर्मिनल की आवश्यकता होती है।Nsp7-11-His6 को पुनः संयोजक Mpro (nsp5-His6) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में UTP युक्त NMPylation डिटेक्शन बफर में 30 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इन्क्यूबेट किया जाता है।3 घंटे के बाद, सामग्री और विधियों में वर्णित अनुसार nsp12-His6 जोड़कर NMPylation परख शुरू करें।Nsp5-His6 (लेन 1) और nsp9-His6 (लेन 2) वाली प्रतिक्रिया को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था।10 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया समाप्त कर दी गई और प्रतिक्रिया मिश्रण को एसडीएस-पेज द्वारा अलग कर दिया गया।प्रोटीन को कूमैसी ब्रिलियंट ब्लू (ए, टॉप) से रंगा गया था।Nsp7-11-His6 अग्रदूत और nsp5-His6 मध्यस्थता दरार से उत्पन्न संसाधित उत्पाद दाईं ओर दिखाए गए हैं।कृपया ध्यान दें (उनके छोटे आकार के कारण) कि nsp7 और nsp11-His6 इस जेल में पता लगाने योग्य नहीं हैं, और प्रतिक्रिया nsp5-His6 (लेन 1 और 4; nsp5-His6 की स्थिति एक ठोस सर्कल द्वारा इंगित की गई है) के साथ पूरक है। या nsp9-His6 (लेन 2) में अवशिष्ट अशुद्धियों के रूप में थोड़ी मात्रा में MBP (खुले घेरे द्वारा दर्शाया गया) होता है क्योंकि उन्हें MBP संलयन प्रोटीन (SI परिशिष्ट, तालिका S1) के रूप में व्यक्त किया जाता है।(बी) Nsp9-His6 वैरिएंट में एक या दो N-टर्मिनल Asn अवशेषों (pp1a/pp1ab में स्थिति के अनुसार अवशेष क्रमांकन) का अभाव है और इसे nsp12-His6 और [α-32P] UTP के साथ शुद्ध और इनक्यूबेट किया गया है।बी, कूमैसी से सना हुआ एसडीएस-पेज शीर्ष पर दिखाया गया है, बी, संबंधित ऑटोरेडियोग्राफ़ नीचे दिखाया गया है।आणविक भार मार्कर की स्थिति (किलोडाल्टन में) बाईं ओर दिखाई गई है।(सी) HCoV-229E nsp9-His6 N-टर्मिनल संरक्षित अवशेषों को Ala या Ser से बदल दिया गया था, और nsp12-His6 मध्यस्थता UMPylation प्रतिक्रिया में प्रोटीन की समान मात्रा का उपयोग किया गया था।प्रतिक्रिया उत्पादों को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था और कोमासी ब्रिलियंट ब्लू (सी, शीर्ष) के साथ दाग दिया गया था, और रेडियोलेबल्ड एनएसपी 9-एचआईएस 6 को फॉस्फोरेसेंस इमेजिंग (सी, मध्य) द्वारा पता लगाया गया था।एक संदर्भ (100% पर सेट) के रूप में जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) प्रोटीन का उपयोग करते हुए, सापेक्ष एनएमपीलेशन गतिविधि (मतलब ± एसईएम) की गणना तीन स्वतंत्र प्रयोगों से की गई थी।(डी) HCoV-229E वाइल्ड-टाइप Huh-7 कोशिकाओं से संक्रमित Huh-7 कोशिकाओं के p1 सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला में वायरस टाइटर्स, और nsp9 में निर्दिष्ट अमीनो एसिड प्रतिस्थापन ले जाने वाले म्यूटेंट को प्लाक परख द्वारा निर्धारित किया गया था।प्रतिकृति-कमी वाले RdRp मोटिफ C डबल म्यूटेंट DD4823/4AA का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।
एनएसपी9 का एन-टर्मिनस (विशेषकर स्थिति 1, 2, 3, और 6) ऑर्थोकोरोनविरिने उपपरिवार (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस6) के सदस्यों के बीच बहुत संरक्षित है।Nsp12-मध्यस्थता वाले nsp9 NMPylation में इन अवशेषों की संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए, nsp9 के एन-टर्मिनस पर लगातार दो Asn अवशेषों को Ala या Ser (अकेले या संयोजन में) से बदल दिया गया था।वाइल्ड-टाइप nsp9 की तुलना में, N3825 को Ala या Ser से बदलने पर nsp12-मध्यस्थता UMPylation में दो गुना से अधिक की कमी आई (चित्र 5C)।हमारे निष्कर्ष के अनुरूप कि NMPylation N-टर्मिनल अवशेषों की साइड चेन के बजाय N-टर्मिनल प्राथमिक एमाइन पर होता है, हमने N3825A और N3825S के प्रतिस्थापन के साथ महत्वपूर्ण अवशिष्ट NMPylation देखा।दिलचस्प बात यह है कि, यदि दूसरे एएसएन को अला या सेर द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, तो एनएसपी9 यूएमपीयलेशन अधिक दृढ़ता से कम हो जाता है (10 गुना से अधिक), जबकि 3, 4 और 6 स्थिति पर अला के प्रतिस्थापन से एनएसपी9 यूएमपीयलेशन पर केवल मध्यम प्रभाव पड़ता है (चित्र 2) ) .5सी).इसी तरह के परिणाम एटीपी, सीटीपी या जीटीपी (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस8) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।सामूहिक रूप से, ये डेटा nsp9 NMPylation में N2826 (nsp9 में स्थिति 2) की मुख्य भूमिका को दर्शाते हैं।
Nsp9 और NMPylation के N-टर्मिनस के बीच कार्यात्मक सहसंबंध के अतिरिक्त साक्ष्य प्राप्त करने के लिए, हमने कोरोना वायरस परिवार के nsp9 अनुक्रम का एक एकाधिक अनुक्रम संरेखण (MSA) किया (104 और 113 अवशेषों के बीच भिन्न) (SI परिशिष्ट, चित्र) एस6 ).कुल मिलाकर, ऑर्थोकोरोनाविरिने उपपरिवार की 5 प्रजातियों की 47 (ज्ञात और कथित) प्रजातियों में, जो विभिन्न स्तनधारियों, पक्षियों और सरीसृप मेजबानों को संक्रमित करती हैं, कुल मिलाकर केवल 8 अवशेष अपरिवर्तनीय पाए गए।जैसा कि पिछले संरचनात्मक अध्ययनों (26 ??28) द्वारा निर्धारित किया गया था, एनएसपी9 के माध्यमिक संरचना तत्वों के बीच चक्रों में विलोपन और सम्मिलन सहित सबसे व्यापक परिवर्तन देखे गए थे।एनएसपी9 के सी-टर्मिनल भाग के β स्ट्रैंड और α हेलिक्स में पांच अपरिवर्तनीय अवशेष पाए गए।तीन अपरिवर्तनीय अवशेष एनएसपी9 के एन टर्मिनस के एनएनई रूपांकन का निर्माण करते हैं।यह पता चला है कि इस रूपांकन का दूसरा असन एकमात्र अपरिवर्तनीय अवशेष है, जिसे दूर से संबंधित मेंढक कोरोनोवायरस के काल्पनिक एनएसपी 9 द्वारा भी साझा किया गया है, और अल्फालेटोवायरस के उपपरिवार लेटोविरिने में माइक्रोहिला लेटोवायरस 1 प्रजाति का प्रतिनिधित्व करता है।फोल्डिंग या ज्ञात आरएनए बाइंडिंग गुणों को बनाए रखने के लिए एनएसपी9 माध्यमिक संरचना तत्वों में अवशेषों के संरक्षण को संरचनात्मक विचारों द्वारा तर्कसंगत बनाया जा सकता है।हालाँकि, यह तर्क एनएनई के संरक्षण पर लागू नहीं होता है, और इस अध्ययन से पहले, ट्रिपेप्टाइड अनुक्रम की भिन्नता को सीमित करने वाली बाधाओं की प्रकृति पूरी तरह से अस्पष्ट थी।
कोरोनोवायरस प्रतिकृति में nsp9-NMPylation और NNE संरक्षण के महत्व को निर्धारित करने के लिए, हमने HCoV-229E म्यूटेंट का उत्पादन किया, जो nsp9 N-टर्मिनल अवशेषों के एकल या दोहरे प्रतिस्थापन को ले जाता है, जो दर्शाता है कि nsp9 NMPylation इन विट्रो में हानिकारक है।शुरू करने से पहले, हम इस प्रश्न का उत्तर देने का प्रयास करते हैं कि क्या ये प्रतिस्थापन (एनएसपी8|9 क्लीवेज साइट के पास) सी-टर्मिनल पीपी1ए क्षेत्र के प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण को प्रभावित करते हैं।एनएसपी9 के एन-टर्मिनस पर संबंधित प्रतिस्थापन वाले एनएसपी7-11 पॉलीप्रोटीन निर्माणों का एक सेट ई. कोलाई में उत्पादित किया गया था और पुनः संयोजक एमप्रो के साथ काटा गया था।चार साइटों (एनएसपी9 फ़्लैंकिंग साइट सहित) का प्रोटीयोलाइटिक दरार किसी भी प्रस्तुत प्रतिस्थापन (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस9) से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं होता है, इन प्रोटीनों में संरचनात्मक परिवर्तनों को छोड़कर जो एमप्रो-मध्यस्थ एनएसपी8|9 दरार (या अन्य) में हस्तक्षेप करते हैं। वेबसाइट।
Huh-7 कोशिकाओं को जीनोम-लंबाई HCoV-229E RNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, nsp9 N टर्मिनस पर संरक्षित NNE ट्रिपेप्टाइड्स (N3825, N3826, और E3827) में Ala या Ser प्रतिस्थापन को एन्कोड किया गया, जिससे पता चला कि अधिकांश उत्परिवर्तन घातक हैं।हम एन-टर्मिनल एएसएन (एन2835ए या एन2835एस) के सेर या अला को प्रतिस्थापित करके वायरस को बचाने में सक्षम थे, लेकिन एनएनई अनुक्रम (एन3826ए, एन3826एस, एनएन3825/6एए) में अन्य एकल और दोहरे उत्परिवर्तन के साथ वायरस को पुनर्प्राप्त करने में विफल रहे। एनएन3825/6एसएस), ई3827ए) (चित्र 5डी)।
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि टिशू कल्चर में कोरोना वायरस की प्रतिकृति प्रतिबंधित (समान या समान) है, जो शरीर में एनएसपी9 एनएमपाइलेशन साइटों के प्राकृतिक उत्परिवर्तन को सीमित करती है, और कोरोना वायरस के जीवन चक्र में इस प्रतिक्रिया की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करती है।
प्रयोगों के अंतिम सेट में, हमने SARS-CoV-2 nsp12 और nsp9 लेबल वाले C-टर्मिनल His6 और ई. कोली में nsp12 के दो उत्परिवर्ती रूप तैयार किए।NiRAN और RdRp डोमेन में सक्रिय साइट अवशेष क्रमशः Ala का उपयोग करते थे (चित्र 6A और SI परिशिष्ट, तालिका S2)।SARS-CoV-2 nsp12 में K4465 HCoV-229E (SI परिशिष्ट, चित्र S2) में K4135 से मेल खाता है, जो NiRAN गतिविधि और HCoV-229E प्रतिकृति (चित्र 3D और E) के लिए आवश्यक साबित हुआ।यह अवशेष धमनी वायरस EAV nsp9 K94 अवशेष से भी मेल खाता है, जिसे पहले NiRAN सेल्फ-यूएमपीयलेशन/सेल्फ-जीएमपाइलेशन (16) के लिए आवश्यक दिखाया गया था।जैसा कि चित्र 6B में दिखाया गया है, SARS-CoV-2 nsp12 में सब्सट्रेट के रूप में nsp9 का उपयोग करके UMP ट्रांसफरेज़ गतिविधि है, जबकि nsp12_K4465A सक्रिय साइट म्यूटेंट निष्क्रिय है।आरडीआरपी मोटिफ सी के एसडीडी विशेषता अनुक्रम में दोहरा प्रतिस्थापन यूएमपी ट्रांसफरेज गतिविधि (चित्रा 6बी) को प्रभावित नहीं करता है, यह दर्शाता है कि आरडीआरपी गतिविधि का एनएसपी9 यूएमपाइलेशन में कोई प्रत्यक्ष प्रभाव नहीं है।सीटीपी, जीटीपी और एटीपी (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस10) का उपयोग करके समान डेटा प्राप्त किया गया था।संक्षेप में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि NiRAN-मध्यस्थता वाले nsp9 NMPylation में ऑर्थोकोरोनोवायरस उपपरिवार के विभिन्न जेनेरा का प्रतिनिधित्व करने वाले कोरोनवीरस में एक रूढ़िवादी गतिविधि है।
SARS-CoV-2 nsp12-मध्यस्थता nsp9 का NMPylation।(ए) कूमैसी सना हुआ एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल एनएमपाइलेशन परीक्षण में प्रयुक्त पुनः संयोजक प्रोटीन दिखा रहा है।नियंत्रण के रूप में, SARS-CoV-2 nsp12 के NiRAN डोमेन (K4465A) और RdRp डोमेन (DD5152/3AA) में सक्रिय साइट प्रतिस्थापन के साथ एक उत्परिवर्ती प्रोटीन का उपयोग किया गया था।अवशेष क्रमांकन pp1ab में स्थिति पर आधारित है।(बी) nsp9-His6 और [α-32P]UTP को nsp12-His6 (जंगली प्रकार [wt] और उत्परिवर्ती) के सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करके UMPylation का पता लगाने का ऑटोरेडियोग्राफ़।लेबल किए गए प्रोटीन का आणविक द्रव्यमान (किलोडाल्टन में) बाईं ओर दिखाया गया है।
NiRAN डोमेन आमतौर पर Nidovirales (16) में संरक्षित होते हैं, जो दर्शाता है कि वे Nidovirus प्रतिकृति के लिए आवश्यक एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं।इस अध्ययन में, हम यह साबित करने में सक्षम थे कि कोरोनोवायरस का NiRAN डोमेन NMP (NTP से उत्पन्न) को nsp9 में स्थानांतरित करता है, जो वायरस प्रतिकृति (26 ?? 29) में शामिल एक रहस्यमय आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन है, ताकि इसे एक प्राकृतिक लक्ष्य के रूप में निर्धारित किया जा सके और कोरोनावायरस आरटीसी का भागीदार।
NiRAN डोमेन तीन अनुक्रम रूपांकनों (एएन, बीएन, और सीएन) को साझा करता है, जिसमें बहुत कम संख्या में अवशेष होते हैं जो मोनोफिलेटिक लेकिन अत्यधिक विभेदित निडोविरालेस ऑर्डर (8, 16) में सभी परिवारों में संरक्षित होते हैं।हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वे संरचनात्मक रूप से प्रोटीन काइनेज-जैसे प्रोटीन के एक बड़े पैमाने पर अनैच्छिक परिवार से संबंधित हैं, जिन्हें मूल रूप से सेलो परिवार (17, 19, 22, 30, 31) कहा जाता था।सेलो-संबंधित प्रोटीन में काइनेज फोल्ड होते हैं, लेकिन शास्त्रीय किनेसेस (22, 32) में कई संरक्षित सक्रिय साइट अवशेषों की कमी होती है।सक्रिय साइट से जुड़े एटीपी अणुओं के रिवर्स ओरिएंटेशन के आधार पर और विशिष्ट इंटरैक्शन द्वारा स्थिर होने पर, सेलो की परिकल्पना की गई और बाद में एएमपी (फॉस्फेट के बजाय) को प्रोटीन सब्सट्रेट (22) में स्थानांतरित करने की पुष्टि की गई, जबकि एक अन्य जीवाणु सेलो-जैसे प्रोटीन YdiU में है हाल ही में टीयर और उसके विभिन्न प्रोटीन सब्सट्रेट्स (33) के अवशेषों के लिए यूएमपी के सहसंयोजक लगाव को उत्प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है।
कोरोना वायरस NiRAN डोमेन के अनुमानित सक्रिय साइट अवशेषों की भविष्यवाणी की पुष्टि और विस्तार करने के लिए, हमने कोरोना वायरस nsp12 (चित्र 3D और E और SI परिशिष्ट, चित्र S3 और तालिका) S1 पर उत्परिवर्तन विश्लेषण करने के लिए जैव रासायनिक और रिवर्स आनुवंशिकी विधियों का उपयोग किया। एस4).डेटा से पता चलता है कि HCoV-229E K4135, R4178 और D4280 को Ala के साथ बदलने से सेल कल्चर में इन विट्रो एनएमपी ट्रांसफरेज़ गतिविधि और वायरस प्रतिकृति समाप्त हो जाती है (चित्र 3D और E और SI परिशिष्ट, चित्र S3), जो NTP γ-फॉस्फेट में उनकी उपस्थिति का समर्थन करते हैं। (K4135, R4178) और सक्रिय साइट धातु आयनों का समन्वय (D4280)।K4135 (17) स्थिति को स्थिर करने के लिए भविष्यवाणी की गई पक्षी के घोंसले के वायरस की सीमा में संरक्षित ग्लू के E4145A प्रतिस्थापन को वायरल प्रतिकृति को खत्म करने के लिए दिखाया गया था, लेकिन आश्चर्यजनक रूप से, इन विट्रो NMPylation परख (चित्रा 3 डी और ई) में गतिविधि को बरकरार रखा गया था। एसआई परिशिष्ट, चित्र एस3 और तालिकाएँ एस1-एस4)।इसी तरह का अवलोकन तब किया गया था जब साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम (ई130ए) (33) के वाईडीआईयू होमोलॉग में संबंधित प्रतिस्थापन पेश किया गया था।कुल मिलाकर, ये डेटा उत्प्रेरक कार्य के बजाय इस संरक्षित अवशेष के नियामक कार्य का समर्थन करते हैं।
HCoV-229E NiRAN डोमेन (8) में नेस्टोवायरस की सीमा के भीतर संरक्षित Phe अवशेष (F4281A) को बदलने से इन विट्रो में NMPylation गतिविधि में कमी आई और सेल कल्चर में वायरस प्रतिकृति में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 3D, E और SI) परिशिष्ट, चित्र S3)।डेटा इस अवशेष के महत्वपूर्ण नियामक कार्य के अनुरूप है, जैसे कि पहले दिखाए गए समरूप डीएफजी रूपांकन पीएचई अवशेष।शास्त्रीय प्रोटीन किनेसेस में, यह Mg2+ बाइंडिंग लूप का हिस्सा है और रीढ़ की हड्डी को इकट्ठा करने और विनियमित करने में मदद करता है???प्रभावी उत्प्रेरक गतिविधि के लिए आवश्यक (32, 34)।क्रमशः K4116 अवशेषों (प्रीएएन मोटिफ में) के लिए Ala और Arg को प्रतिस्थापित करने से, वायरल प्रतिकृति समाप्त हो गई और, जैसा कि अपेक्षित था, पेश किए गए अमीनो एसिड साइड चेन के आधार पर, इन विट्रो में NMP ट्रांसफरेज़ गतिविधि पर अलग-अलग प्रभाव पड़ा (चित्र 3D और E और SI परिशिष्ट) , चित्र S3)।कार्यात्मक डेटा संरचनात्मक जानकारी के अनुरूप है, जो दर्शाता है कि इस अवशेष ने एटीपी फॉस्फेट (17) के साथ बातचीत स्थापित की है।अन्य नेस्टेड वायरस परिवारों के NiRAN डोमेन में, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 की स्थिति पर Lys, Arg या His (8) का कब्जा है, जो दर्शाता है कि इस विशिष्ट अवशेष के कार्यात्मक प्रतिबंध में ढील दी गई है।D4188A और D4283A का प्रतिस्थापन एंजाइम गतिविधि को समाप्त या दृढ़ता से कम कर देता है और वायरस प्रतिकृति को समाप्त कर देता है (चित्र 3)।ये दो अवशेष अधिकांश (लेकिन सभी नहीं) नेस्टेड वायरस (8) में संरक्षित हैं, जो एक महत्वपूर्ण परिवार-विशिष्ट लेकिन संभवतः गैर-उत्प्रेरक कार्य का संकेत देते हैं।कई अन्य Lys और Asp अवशेषों (K4113A, D4180A, D4197A और D4273A) के अला प्रतिस्थापन जो कोरोनाविरिडे या अन्य नेस्टियोविरिडे परिवारों (8) में संरक्षित नहीं हैं, को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था।जैसा कि अपेक्षित था, ये प्रतिस्थापन काफी हद तक सहनीय हैं, कुछ मामलों में एंजाइम गतिविधि और वायरल प्रतिकृति में मामूली कमी आई है (चित्रा 3 और एसआई परिशिष्ट, चित्रा एस 3)।कुल मिलाकर, कोरोनोवायरस उत्परिवर्तन डेटा EAV NiRAN-RdRp (16) के स्व-जीएमपी और रिवर्स जेनेटिक्स डेटा के साथ बहुत सुसंगत है, जिसमें EAV nsp9 (कोरोनावायरस nsp12 ऑर्थोलॉग) अवशेष K94 (HCoV- 229E K4135 के अनुरूप) महत्वपूर्ण कार्य करता है), R124 (R4178 के अनुरूप), D132 (D4188 के अनुरूप), D165 (D4280 के अनुरूप), F166 (F4281 के अनुरूप)।इसके अलावा, HCoV-229E उत्परिवर्तन डेटा पहले से रिपोर्ट किए गए SARS-CoV रिवर्स जेनेटिक्स डेटा (16) के अनुरूप और विस्तारित है, जो कि संबंधित CN मोटिफ Phe-to-Ala उत्परिवर्ती SARS-CoV_nsp12 के लिए देखे गए डेटा के समान है। वर्णित फेनोटाइप -F219A और HCoV-229E_F4281A (चित्र 3 D और E और SI परिशिष्ट, चित्र S3 और तालिका S1-S4)।
ईएवी ऑर्थोलॉग्स (16) की तुलना में, जिसमें यूटीपी और जीटीपी (स्वयं-एनएमपीलेशन प्रतिक्रिया में) के लिए स्पष्ट प्राथमिकता है, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि कोरोनोवायरस नीआरएएन डोमेन (एचसीओवी-229ई और एसएआरएस-सीओवी-2 द्वारा दर्शाया गया) प्रभावी ढंग से हो सकता है। सभी चार एनएमपी को स्थानांतरित कर दिया गया, हालांकि यूएमपी के लिए थोड़ी प्राथमिकता है (आंकड़े 1 और 3)।विशिष्ट एनटीपी सह-सब्सट्रेट की अपेक्षाकृत कम विशिष्टता हाल ही में रिपोर्ट की गई SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 सुपरकंपोजिट संरचना के अनुरूप है, जिसमें ADP-Mg2+ NiRAN की सक्रिय साइट से जुड़ता है, लेकिन एडेनिन भाग के साथ नहीं। विशिष्ट अंतःक्रियाओं के गठन का (17)।हमारे अध्ययन में, NMPylation प्रतिक्रिया में प्रयुक्त न्यूक्लियोटाइड के प्रकार का उत्परिवर्ती प्रोटीन (SI परिशिष्ट, चित्र S3) की गतिविधि पर कोई अंतर प्रभाव नहीं पड़ता है, यह दर्शाता है कि इनमें से कोई भी अवशेष किसी विशिष्ट न्यूक्लियोबेस के बंधन से निकटता से संबंधित नहीं है।कोरोना वायरस और धमनी वायरस के NiRAN डोमेन में देखे गए विभिन्न एनटीपी सह-सब्सट्रेट प्राथमिकताओं के संरचनात्मक आधार और संभावित जैविक महत्व का अध्ययन किया जाना बाकी है;वे सत्य हो सकते हैं या उनके संबंधित अध्ययन की सीमाओं के कारण हो सकते हैं।वर्तमान में, इस बात से इंकार नहीं किया जा सकता है कि धमनी वायरस NiRAN डोमेन की संभावित NMPylate गतिविधि (पहले से विशेषता स्व-NMPylation गतिविधि की तुलना में) में एक अलग सह-सब्सट्रेट प्राथमिकता है, यह ध्यान में रखते हुए कि धमनी और कोरोनोवायरस के बीच समानता है NiRAN डोमेन अपनी सीमा पर है.अनुक्रम-आधारित तुलना (16)।स्यूडोकाइनेज सेलो की तुलना में, जो सहकारक के रूप में एमजी2+ का उपयोग करता है, कोरोना वायरस और धमनी वायरस नीआरएएन की गतिविधि एमएन2+ (16) (चित्र 3सी और एसआई परिशिष्ट, चित्र एस1) पर निर्भर है।एमएन2+ निर्भरता और यूटीपी के लिए स्पष्ट प्राथमिकता प्रोटीन एनएमपाइलेटर्स की एक असामान्य विशेषता है, और हाल ही में साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम के वाईडीआईयू प्रोटीन में इसकी पुष्टि की गई है, जो कोशिकाओं को तनाव प्रेरण सेल एटीपी पूल से बचाने के लिए सख्त एमएन2+-निर्भर प्रोटीन चैपरोन यूएमपाइलेशन को उत्प्रेरित करता है। 33).
कोरोना वायरस NiRAN डोमेन और सेलुलर प्रोटीन किनेसेस (17, 19) के बीच हाल ही में वर्णित संरचनात्मक समानता, NMP को सहसंयोजक रूप से NMP को अन्य प्रोटीनों से जोड़ने की NiRAN की क्षमता के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान करती है, जैसा कि हमने इस अध्ययन में बताया है।हमने HCoV-229E ORF1a द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन पर संभावित NiRAN लक्ष्यों के लिए अपनी खोज पर ध्यान केंद्रित किया, जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से RTC के ORF1b-एन्कोडेड प्रतिकृति (12, 35) की सहायता करने के लिए जाने जाते हैं।हमारे प्रयोग एनएसपी9 के प्रभावी और विशिष्ट एनएमपाइलेशन के लिए निर्णायक साक्ष्य प्रदान करते हैं (चित्र 2)।यदि लक्ष्य प्रोटीन का उपयोग दाढ़ की अधिकता में किया जाता है जो एंजाइम (एनएसपी12) की तुलना में 8 से 10 गुना अधिक है, तो यह पुष्टि की जाती है कि एनएसपी9 पूरी तरह से (मोनो) एनएमपीकृत है (चित्र 4)।हमने निष्कर्ष निकाला कि एनएसपी12 और एनएसपी9 के बीच बातचीत अल्पकालिक है और एनएसपी9 के साथ एक स्थिर कॉम्प्लेक्स नहीं बनाएगी (अन्य आरटीसी सबयूनिट्स की अनुपस्थिति में)।यह निष्कर्ष SARS-CoV प्रोटिओम (35) पर प्रोटीन इंटरेक्शन अध्ययन द्वारा समर्थित है।एमएस विश्लेषण ने एनएसपी9 के एन-टर्मिनल अवशेष के प्राथमिक अमाइन को एनएमपाइलेशन साइट (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस5) के रूप में पहचाना।फॉस्फोरामिडेट बॉन्ड और एन-टर्मिनल अमीनो समूह का गठन स्यूडोमोनास सिरिंज सेलो-मध्यस्थता एएमपीयलेशन प्रतिक्रिया से नीआरएएन-मध्यस्थता एनएमपीलेशन गतिविधि को अलग करता है, जो सीर, थ्र, या टीयर अवशेषों पेप्टाइड एडक्ट पर ओ-लिंक्ड एएमपी के गठन को उत्प्रेरित करता है ( 22), और एस टाइफिम्यूरियम वाईडीआईयू ओ-लिंक्ड (टीयर के साथ) और एन-लिंक्ड (उसके साथ) पेप्टाइड-यूएमपी एडेक्ट्स बनाता है।प्रोटीन के सेलो परिवार पर उपलब्ध सीमित जानकारी से पता चलता है कि इस बड़े प्रोटीन परिवार के सदस्य पेप्टाइड-एनएमपी एडिक्ट्स के निर्माण में काफी भिन्न होते हैं।यह एक दिलचस्प अवलोकन है जो आगे के अध्ययन के योग्य है।
इस अध्ययन में प्राप्त आंकड़ों ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि एनएसपी9 के एनएमपाइलेशन के लिए एक मुफ्त एन-टर्मिनस की आवश्यकता होती है।वायरल प्रतिकृति के संदर्भ में, यह एमप्रो और पीपी1एबी द्वारा मध्यस्थता वाले प्रतिकृति पॉलीप्रोटीन पीपी1ए में एनएसपी8|एनएसपी9 प्रसंस्करण साइट के प्रोटियोलिटिक दरार द्वारा प्रदान किया जाएगा।अधिकांश कोरोनाविरस में, इस विशिष्ट साइट (एचसीओवी-229ई में वीकेएलक्यू|एनएनईआई) और अन्य सभी कोरोनवायरस एमप्रो क्लीवेज साइटों के बीच का अंतर एएसएन है (बजाय अन्य छोटे अवशेष, जैसे कि अला, सेर या ग्लाइ) पी1â पर कब्जा कर लेते हैं???स्थान (36).शुरुआती अध्ययनों में प्राप्त पेप्टाइड क्लीवेज डेटा से पता चला है कि एनएसपी8|एनएसपी9 साइट की क्लीवेज दक्षता अन्य साइटों की तुलना में कम थी, जो दर्शाता है कि 1) सी-टर्मिनल के समय पर समन्वित प्रसंस्करण में इस विशिष्ट साइट की नियामक भूमिका हो सकती है। पीपी1ए क्षेत्र, या 2) ए वायरस प्रतिकृति में विशेष संरक्षित एनएसपी9 एन-टर्मिनस की भूमिका (37)।हमारे डेटा (चित्र 5ए) से पता चला है कि वास्तविक एन-टर्मिनल अनुक्रम को ले जाने वाले एनएसपी9 के पुनः संयोजक रूप को एनएसपी12 द्वारा प्रभावी ढंग से एनएमपीकृत किया गया था।एन-टर्मिनल फ़्लैंकिंग अनुक्रम को कारक Xa (nsp9-His6; SI परिशिष्ट, तालिका S1) या Mpro-मध्यस्थता दरार (nsp7-11-His6; चित्र 5A और SI परिशिष्ट, तालिका S1) द्वारा हटा दिया गया था।महत्वपूर्ण रूप से, बिना काटे गए nsp9-युक्त अग्रदूत nsp7-11-His6 ने nsp12 के NMPylation के लिए प्रतिरोध दिखाया, जो हमारे डेटा के अनुरूप है, यह दर्शाता है कि nsp9-NMP एडक्ट एन-टर्मिनल प्राथमिक एमाइन (SI परिशिष्ट, चित्र S5) के माध्यम से बनता है। .NiRAN सब्सट्रेट विशिष्टता की गहरी समझ हासिल करने के लिए, हमने फिर nsp9 के आसन्न एन-टर्मिनल अवशेषों पर ध्यान केंद्रित किया।अन्य प्रोटीनों की अनुपस्थिति में, वे संरचनात्मक रूप से लचीले होते हैं, जो उन्हें एनएसपी9 (26 28, 38) के बिना लेबल वाले रूप में पहचाने जाने से रोकते हैं, जो उनकी सीमित प्राकृतिक भिन्नता को दर्शाता है। यह महत्वपूर्ण अनुक्रम-विशिष्ट (माध्यमिक संरचना से संबंधित नहीं) के कारण है। एनएसपी9 एन-टर्मिनल टुकड़े का कार्य।इस क्षेत्र में संरक्षित अवशेषों के अला प्रतिस्थापन (आंकड़े 5C और D और SI परिशिष्ट, चित्र S8) से पता चलता है कि N3826 इन विट्रो में nsp9 NMPylation के लिए आवश्यक है, जबकि N3825A और E3827A प्रतिस्थापन NMPylation में कमी लाते हैं, जबकि M3829A और P3830A प्रतिस्थापन नहीं करते हैं .स्पष्ट रूप से nsp9 NMPylation को प्रभावित करते हैं।यद्यपि एन-टर्मिनल एएसएन (एन3825ए, एन3825एस) के प्रतिस्थापन का सेल कल्चर में एनएसपी9 एनएमपाइलेशन और वायरस प्रतिकृति पर केवल मध्यम प्रभाव पड़ता है (चित्र 5सी और डी), एन-टर्मिनल 3825-एनएन डाइपेप्टाइड से एएसएन अवशेष अनुक्रम को हटाना साबित हुआ कि यह वायरस के लिए घातक है, यह दर्शाता है कि एन-टर्मिनस पर दूसरे अवशेष से पहले एक एएसएन अवशेष की आवश्यकता होती है, अधिमानतः एएसएन, हालांकि ऐसा लगता है कि समान अवशेषों के प्रतिस्थापन को आंशिक रूप से सहन किया जा सकता है (चित्र 5बी, सी, और डी)।हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि 3825-एनएन डाइपेप्टाइड, विशेष रूप से कोरोनोवायरस रेंज (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस 6) के भीतर संरक्षित और आवश्यक एन 3826 अवशेष, नीआरएएन की सक्रिय साइट में एनएसपी 9 एन-टर्मिनस का सही बंधन और अभिविन्यास सुनिश्चित करता है।
सभी उपपरिवारों के संरक्षित ग्लू के लिए अला (ई3827ए) को प्रतिस्थापित करने से इन विट्रो में एनएसपी9 एनएमपाइलेशन बरकरार रहता है लेकिन सेल कल्चर (चित्रा 5सी और डी) में वायरस के लिए घातक है, जो इस अवशेष के अतिरिक्त कार्य को दर्शाता है, उदाहरण के लिए, प्रमुख इंटरैक्शन (एनएमपीलेटेड या अनमॉडिफाइड) में ) एनएसपी9 एन-टर्मिनस और वायरस प्रतिकृति में शामिल अन्य कारक।एनएसपी9 उत्परिवर्तन ने एनएसपी9 या किसी भी आसन्न एनएसपीएस (39) (एसआई परिशिष्ट, चित्र एस9) की प्रोटियोलिटिक प्रक्रिया को प्रभावित नहीं किया, यह दर्शाता है कि देखे गए कई एनएसपी9 उत्परिवर्तन के घातक फेनोटाइप सी प्रोटियोलिटिक प्रक्रिया-टर्मिनल पीपी1ए क्षेत्र के विनियमन के कारण नहीं थे। .
उपरोक्त डेटा सबूत प्रदान करता है कि पीपी1ए/पीपी1एबी में एनएसपी8|9 क्लीवेज साइट के एमप्रो-मध्यस्थता उपचार के बाद, एनएसपी9 के एन-टर्मिनस को यूएमपाइलेट किया जा सकता है (या किसी अन्य एनएमपी के साथ आंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है)।इसके अलावा, एनएसपी9 के एन-टर्मिनस (कोरोनावायरस परिवार में एकवचन और अपरिवर्तनीय एएसएन अवशेषों सहित) के उत्कृष्ट संरक्षण और इस अध्ययन में प्राप्त रिवर्स जेनेटिक्स डेटा (आंकड़े 3ई और 5डी) ने हमें यह निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित किया कि वर्णित एनएसपी9 एनएमपाइलेशन जैविक रूप से संबंधित है और कोरोनोवायरस प्रतिकृति के लिए आवश्यक है।इस संशोधन के कार्यात्मक परिणामों का अध्ययन किया जाना बाकी है, उदाहरण के लिए, पहले वर्णित (गैर-विशिष्ट) एनएसपी9 (असंशोधित रूप) आरएनए बाइंडिंग गतिविधि (2628) के संबंध में।एन-टर्मिनल एनएमपाइलेशन प्रोटीन या आरएनए सब्सट्रेट्स के साथ एनएसपी9 की बातचीत या विभिन्न चार-स्तरीय असेंबली के गठन को भी प्रभावित कर सकता है।इन्हें संरचनात्मक अध्ययनों में देखा गया है और कार्यात्मक रूप से कोरोनोवायरस प्रतिकृति से संबंधित होने की पुष्टि की गई है, हालांकि विशेष रूप से इस संशोधन के मामले में (26- ââ29, 40) की अनुपस्थिति में।
हालाँकि कोरोना वायरस NiRAN डोमेन की लक्ष्य विशिष्टता को अभी भी अधिक विस्तार से चित्रित करने की आवश्यकता है, हमारा डेटा दिखाता है कि कोरोना वायरस NiRAN डोमेन की प्रोटीन लक्ष्य विशिष्टता बहुत संकीर्ण है।यद्यपि सभी निडोवायरस परिवारों के NiRAN डोमेन में प्रमुख सक्रिय साइट अवशेषों (8, 16) का संरक्षण इन प्रोटीनों के संरक्षित NMPylator की गतिविधि का दृढ़ता से समर्थन करता है, इस डोमेन के सब्सट्रेट बाइंडिंग पॉकेट अवशेषों की पहचान संरक्षण और संरक्षण की विशेषता बनी हुई है , और निडोविरालेस उद्देश्यों के विभिन्न परिवारों के बीच भिन्न हो सकते हैं।इसी प्रकार, अन्य नेस्टेड वायरस के प्रासंगिक लक्ष्य अभी तक निर्धारित नहीं किए गए हैं।वे एनएसपी9 या अन्य प्रोटीन के दूरस्थ ऑर्थोलॉग हो सकते हैं, क्योंकि पांच प्रतिकृति डोमेन के बाहर के अनुक्रम जो आम तौर पर नेस्टेड वायरस में संरक्षित होते हैं, कम संरक्षित होते हैं (8), जिसमें एमप्रो और नीआरएएन के बीच जीनोम सरणी भी शामिल है, उनमें से, एनएसपी9 में स्थित है कोरोना वाइरस।
इसके अलावा, हम वर्तमान में इस संभावना से इंकार नहीं कर सकते हैं कि NiRAN डोमेन में अतिरिक्त (सेलुलर सहित) लक्ष्य हैं।इस मामले में, यह उल्लेखनीय है कि इस उभरते प्रोटीन एनएमपाइलेटर्स (एनएमपाइलेटर्स) (30, 31) में जीवाणु होमोलॉग में "मास्टर नियामक" प्रतीत होते हैं?एनएमपी विभिन्न प्रकार के सेलुलर प्रोटीनों को उनकी डाउनस्ट्रीम गतिविधियों को विनियमित करने या समाप्त करने के लिए नियंत्रित करता है, जिससे सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया और रेडॉक्स होमोस्टैसिस (22, 33) जैसी विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में भूमिका निभाती है।
इस अध्ययन (आंकड़े 2 और 4 और एसआई परिशिष्ट, चित्र एस3 और एस5) में, हम यह साबित करने में सक्षम थे कि एनएसपी12 ने यूएमपी (एनएमपी) भाग को एनएसपी9 में एकल (संरक्षित) स्थिति में स्थानांतरित कर दिया, जबकि अन्य प्रोटीनों को संशोधित नहीं किया गया था। उपयोग की गई शर्तों के तहत, अच्छी तरह से परिभाषित (ढीले के बजाय) सब्सट्रेट विशिष्टता का समर्थन किया जाता है।इसके अनुरूप, एन-टर्मिनल nsp9 NMPylation की तुलना में, nsp12 की अपनी NMPylation गतिविधि बहुत कम है, इसका पता लगाने के लिए लंबे समय तक ऑटोरैडियोग्राफी एक्सपोज़र समय की आवश्यकता होती है, और nsp12 एकाग्रता में 10 गुना वृद्धि का उपयोग किया जाता है।इसके अलावा, हमारा MS विश्लेषण nsp12 के NMPylation के लिए साक्ष्य प्रदान करने में विफल रहा, जो बताता है कि NiRAN डोमेन स्व-NMPylation (सर्वोत्तम) एक माध्यमिक गतिविधि है।हालाँकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य अध्ययनों ने प्रारंभिक साक्ष्य प्रदान किए हैं कि बैक्टीरियल NMPylate की स्व-एम्पाइलेशन स्थिति अन्य प्रोटीन सब्सट्रेट्स (22, 33) पर उनकी NMPylation गतिविधि को नियंत्रित कर सकती है।इसलिए, ईएवी एनएसपी9 (16) और कोरोना वायरस एनएसपी12 (यह अध्ययन) के लिए रिपोर्ट की गई स्व-एनएमपीलेशन गतिविधियों के संभावित कार्यात्मक प्रभावों की जांच के लिए अधिक शोध की आवश्यकता है, जिसमें सी-टर्मिनल आरडीआरपी डोमेन के फोल्डिंग पर प्रस्तावित चैपरोन जैसा प्रभाव भी शामिल है। 16) ).
पहले, निडोवायरल नीआरएएन डोमेन के संभावित डाउनस्ट्रीम कार्यों के बारे में कई परिकल्पनाओं पर विचार किया गया है, जिसमें आरएनए लिगेज, आरएनए-कैप्ड गनीलेट ट्रांसफरेज़ और प्रोटीन प्राइमिंग गतिविधि (16) शामिल हैं, लेकिन उनमें से कोई भी उपलब्ध डाउनस्ट्रीम कार्यों के साथ संगत नहीं है।निम्नलिखित स्थितियों में प्राप्त जानकारी बिना किसी अतिरिक्त धारणा के बिल्कुल एक ही समय में प्राप्त की गई है।इस अध्ययन में प्राप्त डेटा सबसे अधिक सुसंगत है (लेकिन साबित नहीं कर सकता) कि NiRAN डोमेन प्रोटीन-प्रेरित आरएनए संश्लेषण की शुरुआत में शामिल है।पहले यह माना जाता था कि 5 में NiRAN डोमेन का कार्य??²-आरएनए कैपिंग या आरएनए लिगेशन प्रतिक्रियाएं इनसे और अन्य डेटा के समर्थन से प्रभावित नहीं होती हैं।इसलिए, उदाहरण के लिए, NiRAN की सक्रिय साइट को सामान्य आधार के रूप में संरक्षित Asp को शामिल करने वाला माना जाता है (स्यूडोमोनास सिरिंज सेलो में D252; HCoV-229E pp1ab में D4271; SARS-CoV-2 nsp12 में D208) (SI परिशिष्ट, चित्र 2) ).एस2) (17, 22, 33), जबकि एटीपी-निर्भर आरएनए लिगेज और आरएनए कैपिंग एंजाइम में उत्प्रेरण सहसंयोजक एंजाइम-(लिसाइल-एन)-एनएमपी मध्यवर्ती द्वारा किया जाता है, जिसमें एक गैर-परिवर्तित लिस अवशेष शामिल होता है ( 41).इसके अलावा, संरक्षित प्रोटीन लक्ष्यों के लिए कोरोना वायरस NiRAN की उल्लेखनीय अनुक्रम-आधारित विशिष्टता और NTP सह-सब्सट्रेट्स (UTP को प्राथमिकता देता है) के लिए शिथिल विशिष्टता NiRAN-मध्यस्थता कैपिंग एंजाइम या RNA लिगेज-जैसे कार्यों का विरोध करती है।
जाहिर है, सत्यापित करने के लिए और, यदि सिद्ध हो, तो प्रोटीन-प्रेरित आरएनए संश्लेषण में एनएसपी9-यूएमपी (एनएसपी9-एनएमपी) की संभावित भूमिका के बारे में विस्तार से बताने के लिए बहुत सारे अतिरिक्त काम की आवश्यकता है, जो कई दिलचस्प लेकिन (अब तक) पहले रिपोर्ट की गई रिपोर्टों को जोड़ देगा। .पृथक अवलोकन.उदाहरण के लिए, यह निर्धारित किया गया है कि कोरोनोवायरस के नकारात्मक-स्ट्रैंड आरएनए का अंत ऑलिगो (यू) स्ट्रैंड (42, 43) से शुरू होता है।यह अवलोकन इस विचार के अनुरूप है कि नकारात्मक-स्ट्रैंड आरएनए का संश्लेषण एनएसपी9 के यूएमपीलेटेड फॉर्म को पॉली (ए) टेल (ट्रिगर) से जोड़कर शुरू किया जाता है, जिसे इसके आरएनए बाइंडिंग गतिविधि और/या इंटरेक्शन द्वारा बढ़ावा दिया जा सकता है। एक और आरटीसी प्रोटीन।एनएसपी9 द्वारा प्रदान किए गए यूएमपी हिस्से को जीनोमिक आरएनए या अन्य ऑलिगो (ए) युक्त अनुक्रम में 3??²-पॉली (ए) पूंछ का उपयोग करके एनएसपी 7/8/एनएसपी 12-मध्यस्थता ऑलिगॉरिडिलेशन के लिए "प्राइमर" के रूप में उपयोग किया जा सकता है। पिकोर्नावायरस वीपीजी प्रोटीन (44) के लिए स्थापित तंत्र के समान एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है।यदि प्रस्ताव "गैर-मानक" है तो क्या होगा????(प्रोटीन-प्रेरित) नकारात्मक-स्ट्रैंड आरएनए संश्लेषण की शुरुआत अवलोकनों के लिए एक लिंक प्रदान करती है, जो दर्शाती है कि कोरोनोवायरस नकारात्मक-स्ट्रैंड आरएनए के अंत (42) पर यूएमपी (यूटीपी के बजाय) है, जिसे यह इंगित करने के लिए माना जाता है। न्यूक्लिक एसिड डिसर एक अज्ञात यूरिडीन-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिज़ द्वारा फॉस्फोराइलेटेड अंत को तोड़ देता है।यदि पुष्टि की जाती है, तो यह न्यूक्लिक एसिड हाइड्रोलाइटिक गतिविधि नवजात नकारात्मक स्ट्रैंड के 5² छोर से एनएसपी9 के ऑलिगोमेरिक यूएमपीलेटेड फॉर्म को मुक्त करने में मदद कर सकती है।प्रोटीन प्राइमिंग में एनएसपी9 की संभावित भूमिका पिछले रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययनों के अनुरूप भी है, जिससे पता चला है कि एनएसपी9 (और एनएसपी8) कोरोनोवायरस जीनोम के तीसरे छोर के पास संरक्षित सीआईएस-एक्टिंग आरएनए तत्व के साथ गंभीर और विशेष रूप से बातचीत करते हैं।45).इस रिपोर्ट के अनुसार, इन पिछली टिप्पणियों की अब दोबारा जांच की जा सकती है और आगे के शोध के माध्यम से इसका विस्तार किया जा सकता है।
संक्षेप में, हमारे डेटा ने एन-टर्मिनस पर आरडीआरपी से जुड़े एक मालिकाना नेस्टेड वायरस एंजाइम टैग की विशिष्ट गतिविधि निर्धारित की।कोरोना वायरस में, इस नई खोजी गई NiRAN-मध्यस्थता UMPylator/NMPylator गतिविधि का उपयोग Mn2+ और आसन्न Asn अवशेषों पर भरोसा करने और N-टर्मिनल प्राथमिक अमीन के साथ (कम-ऊर्जा) फॉस्फोरामिडेट बांड के गठन का कारण बनने के लिए किया जाता है।Nsp8|9 क्लीवेज साइट पर Mpro-मध्यस्थता क्लीवेज के माध्यम से, nsp9 लक्ष्य का उपयोग NMPylation के लिए किया जा सकता है, जो प्रोटीज और NiRAN डोमेन के बीच कार्यात्मक युग्मन को दर्शाता है, जो RdRp तक फैला हुआ है।Nsp12 NiRAN सक्रिय साइट और nsp9 लक्ष्य में प्रमुख अवशेषों का संरक्षण, SARS-CoV-2 सहित दो कोरोनवीरस से प्राप्त डेटा के साथ मिलकर, मजबूत सबूत प्रदान करता है कि nsp9 NMPylation एक कोरोनवायरस है, रूढ़िवादी विशेषताएं भी वायरस प्रतिकृति में एक महत्वपूर्ण कदम हैं।उपलब्ध डेटा हमें यह निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित करता है कि प्रोटीन-प्रेरित आरएनए संश्लेषण में एनएसपी9 के एनएमपाइलेटेड रूप की विशिष्ट भूमिका कोरोनोवायरस और अन्य नेस्टेड वायरस के लिए एक उचित परिदृश्य है, और NiRAN अन्य अज्ञात प्रोटीन को भी लक्षित कर सकता है।वायरस को नियंत्रित करें.मेज़बान की बातचीत.यदि पुष्टि की जाती है, तो वायरल आरएनए संश्लेषण में प्रोटीन प्राइमरों की भागीदारी से पहले से पहचाने गए कोरोनोवायरस और पिकोर्नावायरस-जैसे सुपरग्रुप (9) के बीच एमप्रो/3सीएलप्रो और आरडीआरपी डोमेन की अनुक्रम आत्मीयता बढ़ जाएगी, जो अब हाल ही में स्थापित पिसोनिविराइट्स में एकीकृत हो गए हैं। 46) श्रेणी में.
हमारा डेटा यह भी दर्शाता है कि इस अध्ययन में पहचानी गई बुनियादी, चयनात्मक और रूढ़िवादी एंजाइम गतिविधियों का उपयोग एंटीवायरल दवाओं के लक्ष्य के रूप में किया जा सकता है।ऐसे यौगिक जो NiRAN की सक्रिय साइट में संरक्षित एनएसपी9 एन-टर्मिनस के बंधन (और बाद में संशोधन) में हस्तक्षेप करते हैं, उन्हें प्रभावी और बहुमुखी एंटीवायरल दवाओं में विकसित किया जा सकता है, जो विभिन्न (उप)जीनस संक्रमणों से पशु और मानव कोरोना वायरस के उपचार के लिए उपयुक्त हैं। , जिसमें SARS-CoV-2 और मिडिल ईस्ट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस शामिल हैं।
इस अध्ययन में उत्पादित कोरोनोवायरस प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम को HCoV-229E से संक्रमित Huh-7 या SARS-CoV-2 से संक्रमित वेरो E6 से अलग किए गए RNA का उपयोग करके RT-पीसीआर द्वारा बढ़ाया गया था, और मानक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करके डाला गया था।pMAL-c2 (न्यू इंग्लैंड जैविक प्रयोगशाला) या pASK3-Ub-CHis6 (47) अभिव्यक्ति वेक्टर (SI परिशिष्ट, तालिकाएँ S1 और S2)।पीसीआर-आधारित साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन (48) द्वारा एकल कोडन प्रतिस्थापन पेश किए गए थे।एमबीपी संलयन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए, ई. कोलाई टीबी1 कोशिकाओं को उपयुक्त पीएमएएल-सी2 प्लास्मिड निर्माण (एसआई परिशिष्ट, तालिका एस1) के साथ रूपांतरित किया गया।संलयन प्रोटीन को एमाइलोज़ एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया और कारक Xa के साथ साफ़ किया गया।इसके बाद, सी-टर्मिनल His6-टैग प्रोटीन को Ni-इमोबिलाइज्ड मेटल एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी (Ni-IMAC) द्वारा शुद्ध किया गया था जैसा कि पहले बताया गया है (49)।यूबिकिटिन संलयन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए, ई. कोली टीबी1 कोशिकाओं ने उपयुक्त pASK3-Ub-CHis6 प्लास्मिड निर्माण (SI परिशिष्ट, टेबल्स S1 और S2) और pCGI प्लास्मिड डीएनए एन्कोडिंग यूबिकिटिन-विशिष्ट सी-टर्मिनल हाइड्रॉलेज़ 1 (Ubp1) का उपयोग किया।परिवर्तन (47).सी-टर्मिनल His6-टैग किए गए कोरोनावायरस प्रोटीन को पहले वर्णित (50) के अनुसार शुद्ध किया गया था।
HCoV-229E nsp12-His6 का स्व-NMPylation परीक्षण EAV nsp9 (16) में वर्णित अनुसार किया गया था।संक्षेप में, nsp12-His6 (0.5 µM) में 50 mM 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपेराज़ीनेथेनसल्फोनिक एसिड (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM डाइथियोथेरिटोल (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM बफर, इनक्यूबेट होता है निर्दिष्ट एनटीपी और 0.17 µM का मिलान 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए [α32-पी]एनटीपी (3,000 Ci/mmol; हार्टमैन एनालिटिक) से हुआ।Nsp12-मध्यस्थता वाले nsp9 NMPylation के अन्य सभी (मानक) NMPylation परीक्षणों में, प्रतिक्रिया स्थितियों को निम्नानुसार समायोजित किया जाता है: nsp12-His6 (0.05 µM) और nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) की उपस्थिति में ), 5 एमएम डीटीटी, 1 एमएम एमएनसीएल2, 25 µएम ने एनटीपी को दर्शाया, और 0.17 µएम ने मिलान किया [α32-पी]एनटीपी।30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तक इनक्यूबेट करने के बाद, प्रतिक्रिया नमूना एसडीएस-पेज नमूना बफर के साथ मिलाया गया था: 62.5 मिमी ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमेथाइल) एमिनोमेथेन एचसीएल (पीएच 6.8), 100 मिमी डीटीटी, 2.5% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल और 0.005% ब्रोमोफेनॉल नीला।प्रोटीन को 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके विकृत किया गया और 12% एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया।जेल को कोमासी ब्रिलियंट ब्लू सॉल्यूशन (40% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड, 0.05% कोमासी ब्रिलियंट ब्लू आर-250) के साथ तय किया जाता है और रंग दिया जाता है, और 20 घंटे के लिए फॉस्फोरसेंट इमेजिंग स्क्रीन के संपर्क में रखा जाता है (एनएमपीलेशन से एनएसपी 12 का पता लगाने के लिए) या (अधिकतम) 2 घंटे (एनएसपी9 एनएमपाइलेशन का आकलन करने के लिए)।स्क्रीन को स्कैन करने के लिए टाइफून 9200 इमेजर (जीई हेल्थकेयर) का उपयोग किया गया था और सिग्नल की तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए इमेजजे का उपयोग किया गया था।
एमएस विश्लेषण के लिए, 1 µM nsp12-His6 और 10 µM nsp9 (हेक्साहिस्टिडाइन टैग के बिना) का उपयोग NMPylation विश्लेषण (SI परिशिष्ट, तालिका S1) में किया गया था और 500 µM UTP और GTP की बढ़ी हुई सांद्रता का उपयोग किया गया था।उनकी सांद्रता और अपेक्षित प्रोटीन गुणवत्ता के आधार पर, मासप्रेप कॉलम (वाटर्स) से सुसज्जित वाटर्स एक्विटी एच-क्लास एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग 1 से 10 μL बफ़र किए गए प्रोटीन समाधानों को ऑनलाइन डीसेल्ट करने के लिए किया गया था।डिसाल्टेड प्रोटीन को बफर ए (पानी/0.05% फॉर्मिक एसिड) और बफर बी (एसीटोनिट्राइल/0.045% फॉर्मिक एसिड) के निम्नलिखित ग्रेडिएंट के माध्यम से सिनैप्ट जी2एसआई मास स्पेक्ट्रोमीटर (वाटर्स) के इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोत में उत्सर्जित किया जाता है, और कॉलम तापमान होता है 60 डिग्री सेल्सियस और 0.1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर: 2 मिनट के लिए 5% ए के साथ आइसोक्रेटिक रूप से निक्षालन, फिर 8 मिनट के भीतर 95% बी तक एक रैखिक ढाल, और अगले 4 मिनट के लिए 95% बी बनाए रखें।
500 से 5000 m/z की द्रव्यमान सीमा वाले सकारात्मक आयनों का पता लगाया जाता है।स्वचालित द्रव्यमान बहाव सुधार के लिए ग्लू-फाइब्रिनोपेप्टाइड बी को हर 45 सेकंड में मापा जाता है।बेसलाइन और स्मूथिंग में कटौती के बाद औसत स्पेक्ट्रम को डीकंवोल्व करने के लिए MaxEnt1 एक्सटेंशन के साथ MassLynx इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
UMPylated HCoV-229E nsp9 को अनुक्रमण-ग्रेड संशोधित ट्रिप्सिन (सर्वा) जोड़कर पचाया गया और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया।एक क्रोमाबॉन्ड C18WP स्पिन कॉलम (भाग संख्या 730522; माचेरी-नागेल) का उपयोग पेप्टाइड्स को नमक रहित करने और केंद्रित करने के लिए किया गया था।अंत में, पेप्टाइड को 25 μL पानी में घोल दिया गया, जिसमें 5% एसीटोनिट्राइल और 0.1% फॉर्मिक एसिड था।
नमूनों का विश्लेषण एमएस द्वारा ऑर्बिट्रैप वेलोस प्रो मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो साइंटिफिक) का उपयोग करके किया गया था।परम नैनो एचपीएलसी सिस्टम (डायोनेक्स), कस्टम एंड-माउंटेड 50 सेमी से सुसज्जित है??75 μm C18 आरपी कॉलम 2.4 μm चुंबकीय मोतियों (डॉ. एल्बिन मैश हाई परफॉर्मेंस एलसी जीएमबीएच) के साथ पैक किया गया है, प्रोक्सीऑन नैनोस्प्रे स्रोत के माध्यम से मास स्पेक्ट्रोमीटर से ऑनलाइन कनेक्ट करें;300 µm आंतरिक व्यास ×?? में 6 µL ट्रिप्सिन पाचन समाधान इंजेक्ट करें।1 सेमी C18 PepMap पूर्व-एकाग्रता स्तंभ (थर्मो साइंटिफिक)।विलायक के रूप में पानी/0.05% फॉर्मिक एसिड का उपयोग करके, नमूना स्वचालित रूप से 6 μL/मिनट की प्रवाह दर पर फंस गया और अलवणीकृत हो गया।
300 एनएल/मिनट की प्रवाह दर पर ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स के पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए पानी/0.05% फॉर्मिक एसिड (विलायक ए) और 80% एसीटोनिट्राइल/0.045% फॉर्मिक एसिड (विलायक बी) के निम्नलिखित ग्रेडिएंट का उपयोग किया गया था: 4% बी के लिए 5 मिनट, फिर 30 मिनट के भीतर 45% बी तक एक रैखिक ढाल, और 5 मिनट के भीतर 95% विलायक बी तक एक रैखिक वृद्धि।क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम को एक स्टेनलेस स्टील नैनो-एमिटर (प्रोक्सीऑन) से कनेक्ट करें, और 2,300 वी की क्षमता का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमीटर की गर्म केशिका पर सीधे एलुएंट स्प्रे करें। ऑर्बिट्रैप मास विश्लेषक में 60,000 के रिज़ॉल्यूशन वाला सर्वेक्षण स्कैन जुड़ा हुआ है कम से कम तीन डेटा एमएस/एमएस स्कैन के साथ, 30 सेकंड के लिए गतिशील रूप से बाहर रखा गया, रैखिक आयन ट्रैप टकराव प्रेरित पृथक्करण या ऑर्बिट्रप डिटेक्शन के साथ संयुक्त उच्च ऊर्जा टकराव पृथक्करण का उपयोग करते हुए, रिज़ॉल्यूशन 7,500 है।
पोस्ट करने का समय: अगस्त-03-2021